近日，沈阳市第十人民医院结核科团队联合金匙医学研发团队，在国际权威期刊 International Journal of Antimicrobial Agents（最新影响因子4.6）发表了研究论文《Enhanced Targeted NGS Assay for Comprehensive Diagnosis in Tuberculosis and Drug-Resistant Tuberculosis Patients》。研究团队基于多重PCR靶向富集的二代测序技术（tNGS）开发了针对结核病原和耐药诊断的方法，并评估了其分析性能和临床价值。

结核病（TB）及耐药结核（DR-TB）仍是全球重大公共卫生挑战。传统检测方法如涂片、培养、药敏试验存在灵敏度低、耗时长的局限；分子诊断方法如 Xpert MTB/RIF虽然周转时间短，但仅能识别结核分枝杆菌和利福平耐药，无法覆盖其他共感染病原和耐药突变位点。本研究团队开发了一种基于多重PCR的靶向二代测序（tNGS）的结核分枝杆菌病原和耐药突变位点诊断方法，系统评估了其分析性能，并在前瞻性临床队列中进行了临床价值验证。主要意义与结果如下：

01 创新开发并验证了增强型tNGS结核病诊断技术

本研究设计了覆盖结核分枝杆菌复合群（MTBC）、63种常见呼吸道病原体及 158 个耐药突变位点的多重PCR靶向测序方案。方法学验证显示，该检测方法在低浓度样本中仍具备极高的检出能力，检测限（LoD）低至10 copies/mL，在高宿主DNA背景下也能稳定检测，体现了出色的灵敏度、精密度和抗干扰能力。

02 tNGS显示优异的临床诊断性能

在纳入的181例疑似结核患者（支气管肺泡灌洗液与痰液样本）中，tNGS 在确诊组样本中MTBC灵敏度达到94.94%（75/79），全部样本中总体灵敏度为63.95%，特异度为91.18%，显著优于培养及Xpert MTB/RIF方法。此外，tNGS能够同时识别非结核分枝杆菌（NTM）及其他常见呼吸道病原体，显示出在临床鉴别诊断中的优势。

03 准确识别耐药突变，拓展临床治疗决策

tNGS对利福平耐药突变的检出与Xpert MTB/RIF的阳性一致率达92.86%（13/14），同时能覆盖更广泛的一、二线抗结核药物耐药位点，正确识别出多例耐多药（MDR-TB）或准广泛耐药（pre-XDR-TB）患者的耐药特征，为耐药结核患者的个体化治疗决策提供了更加全面而可靠的依据。

结核病每年新发病例超 1000 万例，死亡逾 120 万人，其中耐药结核的诊治是实现 “End TB” 目标的难点。临床上，结核常与非结核分枝杆菌及其他肺部疾病表现相似，增加了鉴别诊断的复杂性。现有检测方法存在局限：培养耗时较长，分子检测覆盖有限。近年来，靶向二代测序（tNGS）因具备靶向富集和高深度测序的优势，被WHO推荐用于结核及耐药检测。本研究基于多重 PCR 建立的增强型 tNGS 技术，可在单一流程中同时实现结核病原检测、耐药突变识别及其他呼吸道病原鉴别，为疑似结核患者的临床诊疗提供更高效、全面的解决方案。

本研究采用多重PCR靶向扩增结合高通量测序的策略，建立了可同时覆盖结核分枝杆菌复合群（MTBC）、63种常见呼吸道病原以及158个与结核耐药相关的突变位点的检测体系。研究设计主要包括三个部分：首先在实验室层面开展方法学验证，系统评估检测限（LoD）、精密度以及高宿主DNA背景下的抗干扰能力；接下来在临床层面开展前瞻性研究，共纳入181例疑似结核患者的痰液和肺泡灌洗液样本，同时进行培养、Xpert MTB/RIF及tNGS检测；将病原检测结果与临床诊断进行比对，从灵敏度、特异度、检出范围、耐药突变识别能力及报告周期等角度，全面比较不同方法对于结核病诊断的差异。

（1）tNGS方法学性能优异

结果显示，tNGS在方法学验证中表现出色，其对结核分枝杆菌符合群的最低检出限（LoD）可达10 copies/mL。在精密度试验中，该方法在多批次操作中均能 100% 检出病原，测得的reads数保持稳定，且引物池在高人源DNA背景下仍能稳定工作。在12例利福平耐药标准样本中，tNGS在其中11例中检出的突变位点与Xpert MTB/RIF探针结果完全一致，而在剩余1例中，tNGS在保持与Xpert MTB/RIF一致的同时还额外检出了新的突变位点。

（2）tNGS提升结核病原临床检出率

181例疑似结核患者经过临床诊断，最终分为结核确诊组79例（有临床病原学证据）、结核临床诊断组68例（无临床病原学证据）和非结核组34例。tNGS在结核确诊组患者中的检出率达到 94.94%（75/79），而在结核临床诊断组的68例患者中，tNGS相比于培养和Xpert MTB/RIF额外检出19例阳性，为临床诊断提供了额外的病原学证据。

整体来看，tNGS的灵敏度为63.95%，特异度为91.18%，灵敏度显著高于培养（41.78%）和Xpert MTB/RIF（52.38%）。此外，tNGS 对非结核分枝杆菌（NTM）的检出灵敏度和特异度分别也达到80.0%和92.94%，同时还识别出包括细菌、真菌、病毒在内的31种其他呼吸道病原体，显示出其在复杂鉴别诊断中的重要价值。

（3）tNGS全面识别结核耐药突变

在耐药突变检测方面，tNGS共在34例TB样本中检出耐药相关突变，其中与Xpert MTB/RIF相比对利福平耐药的阳性符合率（PPA）为 92.86%。tNGS 不仅准确识别了Xpert MTB/RIF可覆盖的利福平耐药突变，还发现了 Xpert MTB/RIF无法检测的其他关键耐药位点。其中，9例样本检测到katG S315T 突变（关联异烟肼耐药），且其中8例同时伴随有rpoB S450L突变（关联利福平耐药）。根据tNGS的耐药预测结果，共有10例患者被判定为MDR-TB或pre-XDR-TB，其中2例同时携带利福平与氟喹诺酮（莫西沙星/左氧氟沙星）耐药突变，提示治疗难度显著增加。

除MDR-TB 与pre-XDR-TB 外，tNGS还识别出若干单药耐药病例，包括 6例链霉素耐药基因突变、1例吡嗪酰胺耐药突变以及7例氟喹诺酮耐药突变。这些耐药突变隐藏在利福平敏感病例中，提醒我们单靠利福平耐药检测难以全面把握耐药风险，tNGS 在揭示完整耐药谱，指导临床治疗方面更具优势。