FocuSCOPE®单细胞靶向测序技术精准解析复杂生物学问题（二）--单细胞EB病毒基因检测
1）EBV相关疾病种类逐渐增多：EBV人群普遍易感，与众多疾病相关，除了熟知的鼻咽癌、胃癌、伯基特淋巴瘤等与EBV有相关性，研究发现一些其他疾病也与EBV相关，如乳腺癌； 2）EBV的致瘤机制复杂多样：不同EBV相关肿瘤致瘤机制不同，EBV对宿主基因调控复杂多样； 3）EBV的存在对相关疾病的治疗预后有指导作用：同一疾病有无EBV的存在，对疾病发展，治疗以及预后不同，如胃癌，探究EBV在治疗过程中的作用； 为了在单细胞水平上提高EBV的检出率，新格元开发FocuSCOPE®EBV检测技术，主要针对EBNA1、EBNA2、EBER1、EBER2、ZEBRA等EB病毒生命周期不同阶段关键基因设计捕获靶点，获取宿主的单细胞转录组信息的同时高效捕获EB病毒基因表达水平。具体流程包括单细胞捕获、细胞裂解、分子标签标记、捕获细胞mRNA、全转录组和EB病毒基因序列富集以及对应文库的构建。具体来看，使用EBV Barcoding Beads捕获EB病毒基因转录本并通过RT-PCR获得cDNA,再以cDNA为模板，EBV Barcoding Beads特异富集引物对EB病毒基因序列进行富集，完成EB病毒基因富集文库构建。 图1 EB病毒生命周期阶段以及关键基因信息 图2 实验流程 1）EBV转录程序因细胞类型而异，从而协助探究EBV感染的细胞及基因表达异质性 2）不同供体和细胞类型对EB病毒感染的敏感性 3）EBV感染疾病的感染阶段分期 4）以EBV作为生物标记物诊断和评估肿瘤扩散及治疗监测 5）器官移植和免疫缺陷疾病患者的EBV相关疾病的监测 人源外周血样本、骨髓样本、胸水样本、淋巴结样本等，适用于EBV感染的样本。 说明：目前项目上只适配人源，如果是人鼠嵌合样本，目标检测人源基因，也可适用。 使用qPCR和荧光流式检测临床病人样本的EBV阳性情况 5名CAEBV患者，1名EBV相关噬血细胞淋巴组织细胞增生症(EBV-HLH)患者，2名健康对照样本（骨髓、PBMC）单细胞FocuSCOPE EBV靶向测序 1名接受同种异体造血干细胞移植（HSCT）治疗的CAEBV患者治疗前后（6个月）的骨髓、PBMC单细胞FocuSCOPE EBV靶向测序 比较CAEBV患者和对照组，感染和未感染细胞之间特定细胞类型基因EBV丰度差异 EBV阳性和EBV阴性样本分组对比分析揭示EBV感染的分子特征 接受同种异体造血干细胞移植（HSCT）治疗的CAEBV患者的各个样本类型的各个细胞类型的EBV丰度分析 CAEBV患者中发现EBV感染的HSCs EBV感染的HSCs表现出更高的分化率 EBV感染影响CAEBV的免疫反应 HSCT清除整个造血系统中EBV感染的细胞 CAEBV疾病起源于受感染的造血干细胞，这可能会导致CAEBV的治疗策略创新 造血干细胞移植（HSCT）是治疗CAEBV患者的有效方法 通过对EBV+/EBV-细胞进行分组对比揭示EBV感染的分子特征 A.造血干细胞（HSC）的特征变化： a.长期（LT-HSC）与短期（ST-HSC）信号（A,B）：EBV感染的HSC表现出更低的LT-HSC特征和更高的ST-HSC特征，表明感染的HSC更倾向于向下游分化。 b.静止状态特征（C）：感染的HSC静止状态特征显著降低，更活跃于分化。 c.向多能祖细胞（MPP）分化（D）：感染HSC显示更高的分化倾向。 B.外周血（PB）细胞的特征变化分别为： a.肿瘤炎症特征（E）：EBV感染导致PB细胞炎症水平升高。 b.干扰素-γ（IFN-γ）产生（F）：感染的外周NK细胞IFN-γ产生显著增加。 c.T细胞信号通路与耗竭特征（G,H）：感染的T细胞信号通路活性增强，同时耗竭评分更高。 C.基因本体（GO）富集分析（I）：EBV感染的T细胞、NK细胞、单核细胞和中性粒细胞中差异表达基因富集于炎症和免疫相关通路。 D.总结：EBV感染显著影响HSC的分化和活性，同时在外周血细胞中诱导炎症反应、增强免疫活性并伴随T细胞耗竭。 通过FocuSCOPE EBV靶向检测揭示HSCT清除造血系统中的EBV感染细胞 (A) UMAP图显示，HSCT成功清除了CAEBV患者（受试者4）造血系统中的EBV感染细胞（红点）。 (B) 饼图展示了HSCT后患者各造血细胞群中EBV感染细胞的比例变化。各细胞类型的EBV阳性细胞比例极低。 Wang J, Su M, Wei N, Yan H, Zhang J, Gong Y, Wu L, Suolitiken D, Pi Y, Song D, Chen L, Liu H, Yang S, Wang X, Wang Z. Chronic active Epstein-Barr virus disease originates from infected hematopoietic stem cells. Blood. 2024 Jan 4;143(1):32-41. doi: 10.1182/blood.2023021074. PMID: 37824804.
